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                人臍血間充質幹細胞采集、分離純化與保存
                時間:2019-11-06 11:28:29  作者:微微  來源:《微創美容外科學》
                順產或剖宮手術中,在胎兒娩出後距胎兒5~7cm處對臍帶進行雙結紮,剪斷臍帶,消毒斷端,穿刺孕婦端其血管抽取臍血,並用肝素20u/ml抗凝。采集的新鮮血液於18℃保存,於12h內完成細胞分離。

                圖片來源於網絡
                  (1)采集
                  順產或剖宮手術中,在胎兒娩出後距胎兒5~7cm處對臍帶進行雙結紮,剪斷臍帶,消毒斷端,穿刺孕婦端其血管抽取臍血,並用肝素20u/ml抗凝。采集的新鮮血液於18℃保存,於12h內完成細胞分離。采集的血液采集過程中盡可能多的將臍血留在臍帶內,有助於提高hHCB-MSC的培養成功率。單份臍帶采集的血量越多,所能獲得的hHCB-MSC就越多,培養成功的概率也就越大。在采集過程中應小心操作,避免按壓子宮或擠壓臍帶和胎盤。采集時間的控制:采集時間是指從胎兒娩出獲得臍帶血開始,到收集相關細胞並培養至培養皿中所用的時間。為了最大限度地保證幹細胞活性,采集時間越短培養效果越好,時間至少控制在15h以內。也有學者認為超過6h即會降低hHCB-MSC的活性而增加其培養難度。
                  (2)分離純化
                  分離臍帶血目前尚無統一的方法,常見的分離方法有以下幾種:
                  ①密度梯度離心法:將臍血滴加在Ficoll-Hypaque或Perocoll分離液表面進行密度梯度離心分離出血液中的單核細胞。此法簡單易行,但操作步驟過多以及必須使用淋巴細胞分離液,有可能增加hHCB-MSC被汙染的風險;
                  ②貼壁篩選法:利用hHCB-MSC容易在塑料材料上貼壁生長的特性,將其與造血系統細胞及淋巴細胞分離並傳代擴增;
                  ③流式細胞儀分〒選法:利用hHCB-MSC大小或細胞表面的特殊標誌,采用流式細胞儀對其進行分選,從而獲得目標細胞;
                  ④免疫磁珠分離法:利用表面覆蓋有特異性抗體的磁珠與間充質幹細胞結合,再用永久磁鐵吸引出間充質幹細胞。
                  目前常用的分離方式是將密度梯度離心法和貼壁篩選法相結合,先用密度梯度離心法從臍帶血中分離出單個核細胞,再利用hHCB-MSC易貼附在塑料材料上生長的特性,用貼壁篩選法將其從造血細胞中分離出來,從而獲得純度較高的MSCs。
                  (3)保存
                  第六代細胞生長至80%~90%融合時,常規消化、離心,加入含10%二甲基ξ亞碸基礎培養基,調整細胞密度為1*109/L進行梯度凍存。首先置-20℃環境中2~3h,再置-70℃過夜,次日投入液氮保存。6個月後取出凍存管ζ ,37℃水浴箱中1~2min解凍,加入基礎培養基混懸後,離心去除二甲基亞碸,再加入基礎培養基,以1*102/L和1*103/L接種至培養皿,置於細胞培養箱中,次日換液,此後3~5d換液一次。
                關鍵字:人臍血間充質幹細胞
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